PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

ABSTRACT.- Menegucci E.A., Dutra I.S. & Döbereiner J. 1998. [Toxicological sensitivity and specificity of the micro-complement fixation test for the detection of botulinum toxins C and D in culture medium and liver of mice.] Sensibilidade toxicológica e especificidade do teste de microfixação de complemento na detecção de toxinas botulínicas C e D em meio de cultura e fígado de camundongo. Pesquisa Veterinária Brasileira 18(2):47-52. Depto Apoio, Produção e Saúde Animal, Unesp-Campus de Araçatuba, Cx. Postal 533, Araçatuba, SP 16015-050, Brazil. The toxicological sensitivity and specificity of the micro-complement fixation test (MCF) for the detection of botulinum toxins C and D were studied in supernatants of the bacterial cultures and in livers of mice inoculated with lethal and sublethal doses. Botulinum toxins C and D were produced in Hemoline culture medium, titered through the determination of LD50 by the mouse test and adjusted to dilutions of 10, 1, 0.1, 0.01 and 0.001 LD50 Two experimental models were used to determine the toxicological sensitivity of MCF in the supernatant of the culture medium with the dilutions described, and also in liver extracts of mice weighing 20 g and inoculated with the same dilutions. Detection of the botulinum toxins was attempted in liver extracts of mice which had received lethal doses of the respective toxins, and in others which had been inoculated with sublethal doses and were sacrificed in intervals of 5 days. The results show that the toxicological sensitivity of MCF, regarding the two types of toxins at the level of 0.001 LD50, was 100% when the supernatants of the culture medium were tested; this means that the sensitivitywas 100 times higher than with the mouse test. The toxicological sensitivity of MCF in the liver extracts of mice inoculated with 1 and 10 LD50 of botulinum toxins C and D was inferior, giving values of 100, 80, 89 and 72% respectively. By this test it was also possible to detect botulinum toxins type C and D in liver extracts of mice inoculated with sublethal doses, up to 15 days after the injection. The specificity of MCF was 88% and 92%, when liver extracts of healthy contral mice were tested and when challenged with antitoxins C and D; and 100% when challenged with the supernatant of the culture medium. These results indicate that MCF could be of importance for research and could substitute in vivo tests.

• Botulinum toxins micro-complement fixation test sensitivity specificity mouse test Toxinas botulínicas microfixação de complemento sensibilidade especificidade camundongo.

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Menegucci E.A., Dutra I.S. & Döbereiner J. 1998. [Toxicological sensitivity and specificity of the micro-complement fixation test for the detection of botulinum toxins C and D in culture medium and liver of mice.] Sensibilidade toxicológica e especificidade do teste de microfixação de complemento na detecção de toxinas botulínicas C e D em meio de cultura e fígado de camundongo. Pesquisa Veterinária Brasileira 18(2):47-52. Depto Apoio, Produção e Saúde Animal, Unesp-Campus de Araçatuba, Cx. Postal 533, Araçatuba, SP 16015-050, Brazil. No presente estudo pretendeu-se verificar a sensibilidade toxicológica e especificidade do Teste de Microfixação de Complemento (MCF) na detecção de toxinas botulínicas C e D no sobrenadante de cultivas bacterianos e em fígados de camundongos inoculados com doses letais e subletais. As toxinas foram produzidas em meio de cultura Hemoline, tituladas através da determinação da DL50 pelo Bioensaio em Camundongo e diluídas nas concentrações de 10, 1, 0, 1, 0,01 e 0,001 DL50. Desta forma, foram utilizadas em dois modelos experimentais, onde foi determinada a sensibilidade toxicológica do MCF no sobrenadante do meio de cultura com as diluições descritas acima e ainda em extratos hepáticos de camundongos com peso corporal de 20g, inoculados com as mesmas diluições. A tentativa de evidenciação das toxinas botulínicas nos extratos hepáticos de camundongos foi realizada através da sua extração após a morte pela administração das doses letais e ainda pelo sacrifício dos animais inoculados -com doses subletais, em intervalos de 5 dias. Os resultados evidenciaram uma sensibilidade toxicológica para o MCF de 100% para os dois tipos de toxinas ao nível de 0,01 DL50, quando testados os sobrenadantes de meio de cultura, portanto 100 vezes superior ao Bioensaio em Camundongo. A sensibilidade toxicológica do MCF, quando examinados extratos hepáticos de camundongos inoculados com 1 e 10 DL50 de toxinas botulínicas C e D, foi inferior, com valores de 100, 80, 89 e 72%, respectivamente. Pelo teste foi possível detectar toxinas botulínicas tipos C e D nos extratos hepáticos de camundongos inoculados com doses subletais até 15 dias após a sua inoculação. A especificidade do MCF foi de 88 e 92%, quando testados extratos hepáticos de camundongos sadios, e confrontados com as antitoxinas C e D; e 100% no sobrenadante do meio de cultura. Os resultados apontam para uma possível utilização do teste como importante instrumento de pesquisa e ainda na eventual substituição dos testes in vivo pelas suas implicações éticas e limitações práticas.

Abstract in English:

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for detection of botulinum type D toxin. The double antibody sandwich ELISA was performed with reference to botulinum type D antitoxin (Statens Seruminstitut, Denmark) as in the solid phase, to sensitize plastic surface, as in the production of the immunoenzymatic conjugate. The sensitivity of ELISA was evaluated by using various dilutions of botulinum type D toxin added to liquid culture or a pool of normal bovine serum. The reactivity was, respectively, 15.6 LD50\ml and 31.2 LD50\ml for mice, with absorbance measured spectrophotometrically at 450 nm using an ELISA microreader. The specificity was demonstrated by the absence of reactivity with botulinum type A, B and E, tetanic and diphteric toxins. However, botulinum type C toxin indicated a partial cross-reactivity dueto comparable common antigenic determinants between type C and D toxins. Considering the results presented in this paper it can be concluded that the assay is particulary useful as a sensitive, fast and efficient screening method for detection of botulinum type D toxin, but it has the sarne limitations for the direct diagnosis of botulism in cattle as encountered with the bioassay in mice, because of the low concentration of circtilating toxin.

• Botulism serologic diagnostic ELISA

Abstract in Portuguese:

Foi desenvolvido um teste imunoenzimático (ELISA) capaz de detectar toxina botulínica tipo D. A técnica empregada foi a de Duplo Anticorpo (ELISA "Sandwich") utilizando-se antitoxinas botulínicas tipo D de referência (Statens Seruminstitut, Dinamarca) tanto na fase de sensibilização das microplacas de polivinilcloreto como para a produção do conjugado imunoenzimático (antisoro botulínico tipo D ligado à peroxidase). A sensibilidade do teste foi verificada através de titulações de toxina botulínica tipo D em fluidos de cultura e adicionada a "pool" de soro bovino normal, resultando em reatividade correspondendo respectivamente a 15,6 DL50\ml e 31,2 DL50\ml para camundongos, determinada espectrofotometricamente em leitor de microplacas. A especificidade, por sua vez, foi demonstrada pela ausência de reatividade com os diferentes tipos de toxinas botulínicas A, B e E, toxinas tetânica e diftérica. Entretanto, foi observado reatividade cruzada parcial com a toxina botulínica tipo C, devido às semelhanças antigênicas entre as toxinas tipos C e D. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que o referido teste pode ser utilizado como um método de triagem, sensível, rápido e eficaz para a detecção de toxina botulínica tipo D, embora, especificamente para o diagnóstico direto do botulismo do bovino, o método tem as mesmas limitações do bioensaio em camundongos por causa da baixa concentração de toxina circulante.

• Botulismo diagnóstico sorológico ELISA

Abstract in English:

A comparison was made between the plate immunodiffusion (ID) test and the micro-serum neutralization (SN) test in the detection of antibodies for Aujeszky's disease virus (ADV) in pig sera, using a total of 813 sera derived from five infected herds. The plate ID test was as sensitive and specific as the micro SN test in detecting positive sera that possessed neutralizing activity only when tested undiluted. Sera with this titer generally reacted by bending the precipitation line formed between the antigen and the reference serum. Sera with SN titers equal to or greater than eight, usually gave two lines of precipitation. The plate ID test was equally efficient and specific in detecting antibodies resulting from a natural infection or from vaccination with an inactivated oil-emulsion vaccine, as well as maternally-derived antibodies in the sera of piglets from vaccinated sows. Of 813 sera assayed in the micro SN test, 295 (36.3%) contained ADV antibody, 382 (47%) were negative and 136 (16.7%) were toxic. The sarne sera assayed in the plate ID test showed 347 (42.7%) positive for precipitating antibodies and466 (57.3%) negative. The major limitation of the SN test was the excessive percentage of sera (16.7%) that were toxic for the indicator cells (chicken embryo fibroblasts), due mainly to bacterial contamination and/or hemolysis as a result bad handling and storage of samples before arriving to the laboratory. The disagreement between the number of positive sera detected by the two tests in favor of the plate ID test, was due to the fact that 52 sera that were positive by this test were toxic when assayed by SN. Under the experimental conditions, the plate ID test was both sensitive and specific for the detection of antibodies for ADV, and as well as being economic, simple and rapid to perform, there is the advantage that it can be used to test moderately contaminated and/or hemolysed sera that are toxic for the indicator cells in the SN test.

• Serum neutralization immunodiffusion diagnosis Aujeszky swine

Abstract in Portuguese:

A comparação do teste de imunodifusão (ID) em placa e o microteste de soroneutralização (SN), na detecção de anticorpos para o vírus da doença de Aujeszky (VDA) em soros suínos, foi realizada em 813 soros oriundos de cinco plantéis infectados com o VDA. O teste de ID em placa foi altamente sensível e especifico, detectando como positivos soros que, no micro-teste de soroneutralização, apenas reagiam quando eram testados sem diluir. Os soros com este título reagiam, geralmente, dobrando a linha de precipitação formada entre o antígeno e o soro de referência. Soros com títulos SN de oito ou superiores apresentavam freqüentemente duas linhas de precipitação. O teste de ID foi igualmente eficiente e específico na detecção de anticorpos da infecção natural, da vacinação com vacina inativada oleosa, bem como de anticorpos transferidos da porca para os leitões via colostro. De 813 soros submetidos ao teste de SN, 295 (36,3%) revelaram anticorpos, 382 (47%) eram negativos e 136 (16,7%) eram tóxicos. Os mesmos soros submetidos ao teste de ID, revelaram 347 (42,7%) positivos para anticorpos precipitantes enquanto que, 466 (57,3%) eram negativos. A maior limitação do teste de SN foi a excessiva percentagem de soros tóxicos (16,7%) para as células indicadoras (fibroblastos de embrião de galinha), principalmente, devido a contaminação bacteriana e/ou hemólise causada por deficiente dessoragem e estocagem antes de serem enviados ao laboratório. A discordância entre o número de soros detectados como positivos para anticorpos em favor do teste de ID, foi devido ao fato de que 52 soros positivos por este teste foram tóxicos no teste de SN. Nas atuais condições, o teste de ID foi sensível e específico na detecção de anticorpos para o VDA e tem a vantagem de ser econômico, simples e rápido de realizar, além de poder testar soros moderadamente contaminados e/ou hemolisados que são tóxicos para as culturas celulares utilizadas no teste de SN.

• Soroneutralização imunodifusão diagnóstico Aujeszky suínos

Abstract in English:

Eleven dairy cows in different stages of lactation were treated with cefa-lak or cefa-lak combined with Procaine Penicillin G. Four cows treated with cefa-lak were paired with four untreated cows and their milk tested for penicillin residue by the Charm Test. Cows treated with cefa-lak only, had 50% of the samples positive at one sample beyond the withdrawal time. Combination of cefa-lak and Procaine Penicillin G also had positive samples after the recommended withdrawal time. Carry over of penicillin residues through the milking equipment was observed. This finding suggests that milking equipment be completely rinsed after milking treated cows, or that treated cows be milked after untreated cows. Sensitivity of the Charm Test was confirmed and the data indicate that new withholding times should be investigated using more animals, so that a definitive recommendation can be made.

• Penicillin detcction in milk radioimmunoassay technique Charm Test cattle

Abstract in Portuguese:

Onze vacas em diferentes fases de lactação foram tratadas com cefa-lak ou cefa-lak em combinação com Penicilina G Procainada, e quatro vacas tratadas com cefa-lak foram pareadas com quatro outras não tratadas. O leite destes animais foi testado pelo ensaio rádio-imunológico para determinar a persistência de penicilina no leite. Das vacas só tratadas com cefa-lak, 50% apresentaram o leite contaminado por penicilina 108 horas após o tratamento, enquanto que a recomendação do laboratório que produz o medicamento indicava uma retenção do leite por 96 horas o tratamento. Animais tratados com cefa-lak em combinação com Penicilina G Procainada também apresentaram amostras positivas além das horas recomendadas para a retenção do produto. Foi observado o transporte de Penicilina, através da ordenhadeira, do leite dos animais tratados para o dos não tratados. Esta observação sugere que uma limpeza completa deva ser feita na ordenhadeira após a ordenha de animais tratados para que esta contaminação não aconteça ou, ainda melhor, que todas as vacas tratadas só sejam ordenhadas depois que todas as vacas não medicadas o tenham sido. A eficiência do ensaio foi observada. Os dados sugerem que deva ser estudado um novo período de retenção para estes produtos. Maior número de animais deverá ser utilizado para que possam ser alcançadas conclusões definitivas.

• Penicilina determinação no leite persistência no leite ensaio rádio-imunológico Charm Test bovinos

Abstract in English:

The agar gel immunodiffusion tests performed in plates and on slides were compared in their efficiency to detect antibodies against the major glycoprotein gp51 of enzootic bovine leukosis virus (BLV). Materiais tested were milk, plasma and serum obtained from cattle belonging to seven dairy herds located in the States of Rio de Janeiro and São Paulo. Both tests were equally inefficient in the detection of antibodies in the milk. The plate immunodiffusion test was more sensitive than the slide test in the detection of antibodies in plasma, although, when the tests were performed with serum, both were equally sensitive in the identification of infected cattle. Out of a total of 1031 sera tested, 361 (35.0%) were identified as positive using the plate test, while the slide test detected 355 (34.4%) positives. It is concluded that- the slide inununodiffusion test can efficiently substitute for the plate immunodiffusion test in the detection of antibodies against gp51 of BLV in the serum, with the additional advantage of utilizing smaller amounts of glycoprotein antigen.

• Enzootic bovine leukosis virus plate immunodiffusion slide immunodiffusion

Abstract in Portuguese:

As provas de imunodifusão em ágar gel, realizadas em placa e em lâmina, foram comparadas quanto à eficiência em detectar anticorpos contra a glicoproteína maior gp51 rio vírus da leucose enzoótica bovina (VLB). As amostras testadas constaram de leite, plasma e soro, obtidos de bovinos pertencentes a sete rebanhos leiteiros dos Estados do Rio de Janeiro e São Paulo. Ambas as provas foram igualmente ineficientes na detecção de anticorpos no leite. A prova de imunodifusão em placa foi mais sensível que a prova em lâmina, na detecção de anticorpos no plasma, porém, quando as provas eram realizadas com soro, as duas eram igualmente sensíveis na identificação de bovinos infectados. De um total de 1031 soros testados, a prova em placa detectou 361 (35,0%) soros positivos enquanto a prova em lâmina 355 (34,4%). Concluiu-se que a prova em lâmina pode substituir a prova em placa eficientemente na detecção de anticorpos contra gp51 do VLB no soro, com a vantagem de utilizar menores quantidades de antígeno glicoprotéico.

• Leucose enzoótica bovina vírus imunodifusão em placa imunodifusão em lâmina